细胞复苏的成败与冻存及复苏优化操作息息相关。上周我们探讨了细胞冻存中常见的错误细节，详见《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇旨在从复苏的角度出发，排查复苏过程中可能遇到的问题。首先，让我们回顾一下细胞复苏的基本步骤：

复苏步骤回顾

1. 提前将水浴锅预热至37℃，并将培养基复温。同时设置好离心机的转速。

2. 准备一个15ml的离心管，加入适量的培养基。

3. 取出冻存管，迅速浸入水浴锅中，并轻轻摇晃，以确保细胞在2分钟内完成融化。

4. 将融化后的细胞悬液慢慢滴入事先准备好的培养基中的离心管中，离心1000rpm 3分钟。

5. 弃去上清，重新悬浮细胞并接种到培养器皿中，最后放入培养箱。

复苏过程中常见的错误操作

1. 如果液氮罐或冰箱与水浴锅距离较远，且未做好保冷措施，就可能导致细胞在运输过程中提前融化（尤其在夏季）。建议将冻存细胞放在干冰或冰盒中，确保安全运输至水浴锅。

2. 在运输冻存管时，避免用手触碰细胞部分或将其放在口袋内。切忌用手直接接触冻存管身，以免局部温度升高导致细胞始融化。应捏住管盖或将其放在容器中进行运输。

3. 不正确的融化方式也会导致细胞死亡。切勿用手捂热冻存管（也不建议搓热），因为手心温度不足以均匀加热细胞，那样会导致细胞死亡。

4. 在水浴过程中未严格控制时间，直接静置于水中而不晃动，可能影响融化效率。细胞复苏应遵循“快速融化”的原则，建议在2分钟内完成融化，水浴时间越长，细胞活率越低。最佳方法是捏住管盖，将管身浸入水中快速摇晃，以促进细胞融化，切忌静置。

5. 水浴结束时若管内仍有较大冰块，可能会导致细胞死亡。这是由于冰块中的细胞升温缓慢而死亡，同时冰块会对已经融化的细胞造成低温损害。如果2分钟内难以融化细胞，可以考虑将水浴锅温度提高至39℃，并加快摇晃速度，建议将冻存管放入一次性PE手套中再进行水浴，以防污染。水浴锅内的水量也需适当，以避免局部温度不足。

6. 融化后若未进行离心去除DMSO，也可能影响细胞存活。有些实验者在细胞融化后直接加10倍培养基稀释，即不离心直接培养，虽然对贴壁细胞可能暂时可行，但并不可持续，且不适用于悬浮细胞。DMSO对细胞存在一定毒性，特别是对一些细胞类型（如HL-60细胞）较为敏感。若不确定自己的细胞对DMSO的敏感性，建议离心去除上清，以确保细胞存活率。

以上经验来自于小尚多年研究的总结，结合冻存篇的内容，基本能解决大多数复苏失败的问题。如果还有遗漏的知识点，欢迎大家在评论区补充讨论。

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