当科研同事讨论他们宝贵的RNA样品时，我们常常听到“把那根试管放在冰上！”以及“我希望它不会降解”。相比于分子生物学研究中常用的其他大分子（如DNA或蛋白质），RNA在本质上不够稳定。因此，CRISPR/Cas9实验中使用的RNA（通常称为gRNA）同样面临着“易碎”的问题。为了解决这一问题，研究表明通过化学修饰，gRNA可以增强抵抗降解的能力，同时仍能有效引导Cas9产生靶向断裂的功能。这些技术进步提高了靶向效能，缓解了对RNA稳定性的过度忧虑。

有些gRNA的修饰不仅提升了其稳定性，还增加了其功能多样性，甚至改变了其激活方式。例如，在CRISPR/Cas9的靶向识别序列中，约20个核苷酸的gRNA可通过稳定修饰来增强其功能。这些RNA分子易受到细胞质和核酸酶的攻击，因其被识别为外源RNA。因此，为了保护RNA不被降解，研究者提出了一些简单的修饰方法，这些方法在RNA的糖或磷酸骨架上进行改造，从而提高其稳定性。

令人赞叹的是，自然界早已进化出防止重要细胞RNA分子被降解的方法。其中最普遍的修饰是2'-O-甲基化，通过在核糖的2'羟基上添加甲基来保护RNA不受外部降解。在同一位置的另一种稳定修饰是2'-氟修饰，它用氟原子取代了2'位置的羟基。类似地，一种流行的稳定修饰是在糖环中引入3'-硫代磷酸酯键，以替代非桥接磷酸氧。而其他有效的骨架修饰还包括酰胺键、锁定核酸和限制性乙基。

那么，哪种RNA骨架修饰效果最佳呢？研究发现，将几种修饰结合在一起，如将硫代磷酸酯与2'-O-甲基化联用，比单独使用任何一种修饰更为稳定。这些修饰可以通过市面上的试剂盒在实验室内实现，或者在购买gRNA时作为合成修改选项同步订购。这些修饰通常会融入到crRNA分子的末端（通常是前3个核苷酸中的1-3个被修饰），以确保最佳的稳定性和有效性。

除了RNA之外，什么比RNA更稳定？答案是脱氧核糖核酸（DNA）。在预算有限的情况下，提升gRNA效率的一种方法就是简单地将部分核糖核苷酸替换为脱氧核苷酸。含有部分DNA的gRNA相较于纯RNA，对Cas9蛋白表现出更好的稳定性与靶向效率。同时，锁定核酸或桥接核酸也可以有效地引入到gRNA中，这些修饰使得RNA的构象更为受限，从而提高错配鉴别的能力，并增强核酸酶抗性，从而减少脱靶事件。

使用化学RNA修饰提高稳定性的一些方法是在CRISPR/Cas9形成之前就已开发，应用于siRNA和反义寡核苷酸等。其中，一些合成修饰，特别是那些不含5'-三磷酸盐的gRNA修饰，有助于降低由外源RNA引发的先天免疫反应。这在实验需要维护细胞活性或关注免疫反应时，显得尤为重要。

当前gRNA修饰的进展已经实现了光激活和光切割技术，通过在gRNA的20nt靶向区域嵌入特定的可光切割接头，形成了可光切割向导。这样的gRNA在适当的光照条件下迅速失效，使其无法继续参与后续实验。同时，通过光激活的gRNA能够在短暂光照后获释，从而激活CRISPR/Cas9系统进行靶向编辑。

针对靶向实验对gRNA进行染料标记，可以实现转染效率的可视化，甚至在细胞实验中进行定位追踪。有许多适合的染料可供选择，从DIY试剂盒到带标签的商业合成染料均可选择。在单个向导系统中，尽管您不一定需要这种方案，但仍可根据需要选择染料。

在CRISPR/Cas9这个实验模块中，希望您的学习进展顺利，如果您需要与Cas蛋白相关的材料，欢迎关注尊龙凯时即将推出的CRISPR/Cas系列蛋白产品，期待与您相遇。